Редактирование генов стало безопаснее
Прогресс науки — это что-то вроде блуждания исследователя по неизведанным джунглям. Часто густой подлесок может показаться непроходимым, но в определенные привилегированные моменты открывается прояснение и появляется совершенно новый ландшафт.
Нечто подобное происходит в области биологии с недавним открытием мощных методов для вмешательства в генетический код жизни. Новый метод редактирования генов с простотой компьютерных функций вырезания и вставки может оказаться более важным, чем расщепление атома, и представляет собой серьезный прогресс в войне против смертельных болезней .
Прорыв, известный как CRISPR, был встречен с восторженным оптимизмом и серьезным опасением.
В исследовании, появившемся в расширенном онлайн-издании журнала Nature Communications , Карен Андерсен, Самира Киани и их коллеги из Университета штата Аризона описывают метод придания инструменту редактирования генов CRISPR-Cas9 «иммуносилентности», потенциально позволяющему редактировать и восстанавливать гены. быть выполненным надежно и скрытно.
Исследование является первым, чтобы точно предсказать доминантные сайты связывания или эпитопы, ответственные за иммунное распознавание белка Cas9, и экспериментально нацелить их на модификацию. Полученные данные приближают CRISPR к безопасному клиническому применению.
Андерсон является профессором в Центре персонализированной диагностики Biodesign Virginia G. Piper и Школы естественных наук ASU. Она также является доцентом медицины в клинике Майо в Аризоне. Киани недавно присоединилась к Институту биодизайна в дополнение к своим назначениям в Школе естественных наук АГУ и в Школе биологических и инженерных систем здравоохранения. Ее научные интересы включают использование методов синтетической биологии для повышения безопасности CRISPR.
Древний инструмент, футуристическая наука
Еще в 1987 году группа исследователей в Осаке, Япония, обнаружила нечто особенное. Идентичные генетические последовательности, по-видимому, неоднократно возникали в бактериальном геноме кишечной палочки . Эти палиндромные последовательности были разделены сокращенными фрагментами ДНК различного состава.
Природа этих странных повторяющихся последовательностей и любопытных фраз ДНК, разделяющих их, была загадкой. Примечательно, что они начали появляться у других бактерий. Действительно, явление казалось повсеместным, и гонка за объяснениями началась.
Сегодня мы знаем, что исследователи наткнулись на ранее неизвестную бактериальную иммунную систему — CRISPR (для кластерных регулярно пересекающихся коротких палиндромных повторов).
CRISPR опирается на два основных компонента. Первая, известная как направляющая РНК, является своего рода молекулярной гончей, отвечающей за определение местоположения определенного сайта в геноме, который необходимо модифицировать или отключить. Второй компонент, известный как Cas9, представляет собой особый тип белка, известный как эндонуклеаза. Он функционирует как пара острых как бритва подрезающих ножниц, прорезая двухцепочечную ДНК в нужном месте, расположенном направляющей РНК.
Когда бактерия, подобная E.coli , заражается незнакомым вирусом, известным как бактериофаг, активируется система CRISPR. Если механизмы бактериальной защиты успешно отключают вирус, CRISPR разрезает ДНК захватчика на кусочки и сохраняет эти фрагменты в некой геномной библиотеке. Последующее вирусное нападение на бактерию заставит CRISPR сравнить сегменты ДНК вируса-нарушителя с базой данных бактерий о фрагментах ДНК предыдущих вирусных атак. Когда направляющая РНК обнаруживает совпадение вдоль ДНК вируса, она связывается с комплементарной последовательностью, и белок Cas9 разрывает ДНК, уничтожая вирус.
Природа 2.0
Умные исследователи вскоре осознали потенциал CRISPR-Cas9 в качестве универсального инструмента для редактирования генов, полезного не только для модификации выбранных областей по всему бактериальному геному, но и для геномов всех живых организмов, включая человека. Возможности ошеломляют и не ограничиваются эффективным лечением широкого спектра генетических заболеваний. Впервые может быть возможно исправить генетические опечатки Природы, излечивая многие из этих болезней напрямую и предотвращая возникновение других.
CRISPR также обладает потенциалом радикально трансформировать экосистемы и был предложен в качестве средства для уничтожения таких болезней, как малярия, путем выведения комаров, которые приводят их к вымиранию, с помощью методов CRISPR, известных как генные побуждения.
Впервые в истории Земли один вид держит ключ к управлению ходом своей собственной эволюции (не говоря уже об эволюции бактерий, жирафов, деревьев красного дерева и всей планетарной жизни). В настоящее время существуют запреты на усилия по редактированию генов у людей, которые могут передаваться через зародышевую линию последующим поколениям, но, по крайней мере, в одном случае эти границы были зловеще превышены. Метод CRISPR настолько мощен и универсален, что, вероятно, существует несколько областей прикладной биологии, которые не будут затронуты им.
Но прежде чем CRISPR сможет предпринять свои первые пробные шаги в клинике, необходимо решить ряд вопросов безопасности, начиная с генного среза белка Cas9.
«Будучи такой же социальной революцией, как технологической революцией, многие исследователи начали изучать этические, социальные, нормативные и нормативные вопросы, связанные с использованием CRISPR», — говорит Киани. «Техника безопасности для решения проблем управляемости, специфичности и побочных эффектов лечения CRISPR получила значительный импульс, и возникли этические дебаты для обеспечения правильного использования технологии. Моя лаборатория заинтересована в решении обеих проблем».
Управление иммунитетом
Cas9 — это точный и универсальный инструмент, заменяющий ранние, неточные и неэффективные методы редактирования генов быстрым, недорогим и смертельно точным режущим устройством. Но Cas9 в своем родном виде может плохо переноситься организмом человека.
Обеспечение безопасности технологии CRISPR для клинического использования является главной задачей, и проблема является сложной. Одна из них заключается в том, чтобы центральный механизм CRISPR не распознавался иммунной системой пациента как иностранная организация и не подвергался нападениям. Иммунный ответ такого рода может вызвать значительную токсичность. (Ранний, до CRISPR метод введения измененных генов для исправления редкого генетического расстройства привел к трагедии, когда восстание иммунной системы вызвало полиорганную недостаточность и смерть. Сегодня улучшенные векторы для генной терапии привели к более безопасному лечению ряда генетических заболеваний. расстройства, хотя «нецелевые» последствия этих вмешательств остаются важной проблемой.)
Белок Cas9 получен из распространенной бактерии streptococcus pyogenes . «Проблема, — говорит Андерсон, — в том, что многие из нас уже невосприимчивы к стрептококку. Если у вас была стрептококковая инфекция группы А, возможно, у вас уже был иммунитет к этому белку».
S. pyogenes — круглая бактерия, которая обычно колонизирует горло, слизистую оболочку половых органов, прямую кишку и кожу, поражая ежегодно 700 миллионов человек во всем мире. Он ответственен за заболевания, начиная от ревматизма и ревматического заболевания сердца до скарлатины и стрептококкового фарингита — обычно известного как острый фарингит.
В предыдущих усилиях по редактированию генов клетки были удалены из тканей человека, реинжинирированы и заменены в организме. Мощь CRISPR позволяет исследователям модифицировать ДНК в ткани живого человека и даже нацеливаться на множественные модификации генов с помощью одного вмешательства CRISPR. «Если вы хотите подумать о восстановлении клеток, находящихся в каком-либо органе, таких как клетки печени, почек или головного мозга, — говорит Андерсон, — то вам нужно экспрессировать бактериальный белок там». Именно здесь угроза запуска иммунного ответа на Cas9 становится серьезным препятствием.
Cas9 идет инкогнито
Новое исследование подтверждает, что Cas9 действительно является иммуногенным для людей и что существующее ранее воздействие S. pyogenes может стимулировать Т-клетки организма к иммунной атаке против бактериального белка. Когда было проведено скрининг 143 образцов крови, 82 из них (или 57,3 процента) показали обнаруживаемые уровни антител к S. pyogenes.
Далее в исследовании описывается попытка создать полнофункциональную версию Cas9, пригодную для редактирования генов, которая не распознается и не нацелена иммунной системой. Для этого исследователи определили области связывания антител с молекулой Cas9 (известные как эпитопы), которые были непосредственно вовлечены в запуск распознавания и атаки Т-клеток.
Две мутации в так называемых якорных остатках эпитопа Cas9 были исследованы индивидуально и в комбинации для оценки их влияния на иммуногенность. Модификация этих областей только одной аминокислотой привела к созданию версии Cas9, которая могла бы работать под прикрытием. Реакционная способность Т-клеток к мутированному пептиду продемонстрировала снижение в 25-30 раз, при этом сохраняя способность Cas9 разрезать ДНК без изменений.
«Это уникальная часть того, что мы сделали», — говорит Андерсон. «Мы взяли эти доминантные эпитопы и попытались заставить их замолчать, просто выполнив одну или две мутации в гене Cas9. Но мы восстановили его, чтобы ген оставался функциональным. Он не является иммунологически молчаливым, но более тихим». Действительно, результаты исследования подтвердили, что в культивируемых клетках реинжинирированный Cas9 был менее иммунологически активным, сохраняя при этом свои функциональные свойства. Автор подчеркивает, что метод может быть объединен с другими стратегиями для дальнейшего повышения безопасности CRISPR и снижения потребности в иммунодепрессантах.
В настоящее время исследуются новые интересные направления, которые позволят использовать CRISPR для индуцирования эпигенетических изменений, включения молчащих генов, изменения активности нарушенных генов или иным образом изменения экспрессии генов без постоянных изменений в ДНК. Такие вмешательства потребуют, чтобы система CRISPR оставалась эффективной в организме гораздо дольше, возможно, недели или месяцы. Здесь потенциальный иммунитет к Cas9 будет еще более важным фактором. Индивидуальный пошив эпитопов для подавления иммунного ответа на Cas9 предлагает привлекательный подход.
«Мы надеемся, что это исследование положит начало многим усилиям, которые в совокупности позволят решить вопрос иммуногенности CRISPR для клинических испытаний», — говорит Киани.
